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發(fā)布于 2023-08-11
提到細(xì)胞凋亡，想必大家都不陌生，咱們這個(gè)領(lǐng)域的，先不說本科的時(shí)候?qū)W過，考研的時(shí)候怎么說它也是重要考點(diǎn)之一?；蛟S此時(shí)您的腦袋瓜子里立馬浮現(xiàn)出課本上那個(gè)經(jīng)典的凋亡信號(hào)通路圖......額，還有點(diǎn)記不清......沒關(guān)系，今天小編帶您回顧一下經(jīng)典的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，再看看它常見的檢測方法。
☆細(xì)胞凋亡
·細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞主動(dòng)有序的死亡，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用，它并不是病理?xiàng)l件下自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為了更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭取的一種死亡。
·細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路
凋亡信號(hào)通路主要包括Caspase依賴型細(xì)胞凋亡和Caspase非依賴型細(xì)胞凋亡。
☆細(xì)胞凋亡常用檢測方法
想要了解凋亡常用的檢測方法，首先要知道凋亡的形態(tài)學(xué)變化。形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡的變化是多階段的，細(xì)胞凋亡往往涉及多個(gè)細(xì)胞，即便是一小部分細(xì)胞也是非同步發(fā)生的。首先出現(xiàn)的是細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周圍的細(xì)胞脫離，然后是細(xì)胞質(zhì)密度增加，接下來會(huì)發(fā)生一系列的變化：線粒體膜電位消失；通透性改變；釋放細(xì)胞色素C到胞漿；核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎；DNA降解成為約180bp-200bp片段，胞膜有小泡狀形成；膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面；胞膜結(jié)構(gòu)仍然完整，最終可將凋亡細(xì)胞遺骸分割包裹為幾個(gè)凋亡小體，無內(nèi)容物外溢。
細(xì)胞凋亡檢測通常有形態(tài)學(xué)觀察方法、DNA凝膠電泳、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)核小體測定、流式細(xì)胞儀定量分析、Western blot檢測等。
（1）形態(tài)學(xué)觀察
電鏡觀察：可見凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實(shí)，細(xì)胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體及凋亡小體被臨近吞噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。
（2）DNA凝膠電泳
細(xì)胞凋亡時(shí)主要生物化學(xué)特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮，染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂，形成180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜（DNA ladder）。通過提取DNA、電泳、UV下可見DNA ladder。此方法是判斷細(xì)胞有無凋亡發(fā)生的一種簡便方法，比較適用于體外培養(yǎng)的非增殖性細(xì)胞的檢測。
（3）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)核小體測定
凋亡細(xì)胞的DNA斷裂使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測。
檢測步驟
① 將凋亡細(xì)胞裂解后高速離心，其上清液中含有核小體；
② 在微定量板上吸附組蛋白體；
③ 加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合；
④ 加辣過氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結(jié)合；
⑤ 加酶的底物，測光吸收值。
此方法優(yōu)點(diǎn)：敏感性高、應(yīng)用廣泛、操作簡單；缺點(diǎn)：不能精確定量。
（4）Annexin V/PI法
正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡細(xì)胞中，PS會(huì)從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。用熒光素（FITC、Alexa Fluor488等）標(biāo)記的Annexin-V作為探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而將細(xì)胞核染紅。因此將Annexin-V與PI結(jié)合使用，就可以檢測出細(xì)胞群體中的早期凋亡細(xì)胞與晚期凋亡細(xì)胞
（5）TUNEL法
細(xì)胞凋亡中，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）。
常用的標(biāo)記系統(tǒng)：生物素標(biāo)記的dUTP、地高辛標(biāo)記的dUTP、熒光素標(biāo)記的dUTP、溴分子標(biāo)記的dUTP；
常用的顯色系統(tǒng)：Anti-biotin/digoxin/biotin- HRP和DAB；FITC-dUTP/BrdU和流式細(xì)胞儀。
（6）Western blot檢測
分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。
（7）熒光分光光度計(jì)分析
活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據(jù)這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物 ）。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí)，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強(qiáng)度的大小，可以測定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。
（8）其他凋亡相關(guān)因素分析
1）△Ψm dissipation（線粒體跨膜電位的消失）：TMRM（發(fā)紅色熒光），細(xì)胞膜熒光探針DiOC6（3），碘化物（發(fā)綠色熒光）、Rhodamine 123（發(fā)黃綠色熒光）、JC-1（單體形式綠色熒光；多聚體形式紅色熒光）【abs50016-100T：線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)】，這些染料對線粒體膜電位非常敏感，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。
2）細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測：通過熒光染料Monochlorobimane（MCB）體外檢測凋亡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中谷胱甘肽的減少來檢測凋亡早期細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化。
3）檢測線粒體產(chǎn)生的ROS：無熒光的HE（氫化乙啶）可被ROS氧化為EthBr（溴乙啡啶），發(fā)紅色熒光。NAO（烷化吖啶橙，可發(fā)熒光）能與非氧化的心磷脂（可被ROS氧化）反而失去熒光。